Was ist Fluoreszenz?

Fluoreszenz, ein chinesischer Begriff, der auch als «yingguang» geschrieben wird, bezeichnet ein kaltes Lumineszenzphänomen, bei dem eine Substanz Licht emittiert, nachdem sie durch einfallendes Licht einer bestimmten Wellenlänge—typischerweise ultraviolettes oder Röntgenlicht—angeregt wurde. Wenn eine Substanz bei Raumtemperatur Energie aus solchem einfallenden Licht aufnimmt, gelangt sie in einen angeregten Zustand und de-exitiert sofort daraufhin, wobei sie Licht mit einer längeren Wellenlänge emittiert, als das des einfallenden Lichts (in der Regel innerhalb des sichtbaren Spektrums). Bei vielen fluoreszierenden Substanzen hört die Emission unmittelbar auf, sobald das einfallende Licht abgeschaltet wird. Das so emittierte Licht mit diesen Eigenschaften wird als Fluoreszenz bezeichnet. Darüber hinaus gibt es einige Substanzen, die auch noch relativ lange nach Abschalten des einfallenden Lichts weiterhin Licht emittieren; dieses Phänomen nennt man Phosphoreszenz. Im alltäglichen Leben bezeichnen Menschen oft allgemein jedes schwache Leuchten als Fluoreszenz, ohne die zugrundeliegenden Mechanismen, die für die Lumineszenz verantwortlich sind, genau zu untersuchen oder zu unterscheiden. Zudem bezieht sich der Begriff auch auf kühles Licht mit niedriger Temperatur (nicht auf Farbtemperatur).

Das Prinzip hinter der Fluoreszenz

Wenn Licht auf bestimmte Atome trifft, bewirkt die Energie des Lichts, dass einige Elektronen, die den Atomkern umgeben, von ihren ursprünglichen Bahnen auf energiereichere Bahnen springen – sie wechseln vom Grundzustand in den ersten angeregten Singulett-Zustand oder in den zweiten angeregten Singulett-Zustand und so weiter. Da der erste angeregte Singulett-Zustand oder der zweite angeregte Singulett-Zustand instabil sind, kehren sie schließlich wieder in den Grundzustand zurück. Wenn die Elektronen vom ersten angeregten Singulett-Zustand in den Grundzustand zurückfallen, wird die überschüssige Energie in Form von Licht abgegeben, wodurch Fluoreszenz entsteht.

Fluoreszenz ist die Emission von Licht durch eine Substanz, nachdem diese Licht oder andere elektromagnetische Strahlung absorbiert hat. In den meisten Fällen hat das emittierte Licht eine längere Wellenlänge und geringere Energie als das absorbierte Licht. Wenn jedoch die Absorptionsintensität ausreichend hoch ist, kann eine Zwei-Photonen-Absorption auftreten, was zu einer emittierten Strahlung mit kürzerer Wellenlänge führt als das absorbierte Licht. Wenn die Wellenlänge der emittierten Strahlung mit der des absorbierten Lichts übereinstimmt, spricht man von resonanter Fluoreszenz. Ein häufiges Beispiel ist die Absorption ultravioletten Lichts durch eine Substanz, die daraufhin sichtbare Fluoreszenz emittiert. Die fluoreszierenden Lampen, die wir im Alltag verwenden, funktionieren nach diesem Prinzip: Die Phosphorschicht im Inneren des Lampenrohrs absorbiert das ultraviolette Licht, das vom Quecksilberdampf im Rohr emittiert wird, und strahlt anschließend sichtbares Licht wieder ab, sodass es für das menschliche Auge sichtbar wird.

Fluoreszenzparameter

(1) Anregungsspektrum: Die Beziehung zwischen der Intensität oder Lumineszenzeffizienz einer bestimmten Emissionslinie oder -bande eines lumineszierenden Materials und der Wellenlänge des Anregungslichts bei Bestrahlung mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen.

(2) Emissionsspektrum: Die Variation der Intensität der Lumineszenz bei verschiedenen Wellenlängen, wenn ein lumineszierendes Material durch ein bestimmtes Anregungslicht angeregt wird.

(3) Fluoreszenzintensität: Die Fluoreszenzintensität hängt mit Faktoren wie der Fluoreszenzquantenausbeute, dem Extinktionskoeffizienten und der Konzentration des Stoffes zusammen.

(4) Fluoreszenzquantenausbeute Q: Die Quantenausbeute gibt an, inwieweit eine Substanz absorbierte Lichtenergie in Fluoreszenz umwandeln kann; sie ist das Verhältnis der Anzahl der von einer fluoreszierenden Substanz emittierten Photonen zur Anzahl der absorbierten Photonen.

(5) Stokes-Verschiebung: Die Stokes-Verschiebung ist der Unterschied zwischen der Wellenlänge der maximalen Fluoreszenzemission und der Wellenlänge der maximalen Absorption.

(6) Fluoreszenzlebensdauer: Wenn ein Lichtstrahl eine fluoreszierende Substanz anregt, absorbieren die Moleküle des fluoreszierenden Materials Energie und wechseln vom Grundzustand in einen angeregten Zustand. Anschließend emittieren sie Fluoreszenz in Form von Strahlung, während sie in den Grundzustand zurückkehren. Die Fluoreszenzlebensdauer ist definiert als die Zeit, die benötigt wird, damit die Fluoreszenzintensität der Moleküle auf 1/e ihrer maximalen Intensität abfällt, sobald die Anregung beendet wird.

Cadmiumselenid-Quantenpunkte emittieren Fluoreszenz, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden.

Anwendungen der Fluoreszenz

Beleuchtung

Leuchtstofflampe

Eine gängige Leuchtstofflampe ist ein hervorragendes Beispiel hierfür. Das Innere des Lampenrohrs wird evakuiert und anschließend mit einer kleinen Menge Quecksilber gefüllt. Wenn zwischen den Elektroden im Inneren des Rohrs eine elektrische Entladung stattfindet, emittiert das Quecksilber Licht im ultravioletten Spektrum. Dieses ultraviolette Licht ist unsichtbar und gesundheitsschädlich für den Menschen. Deshalb ist die innere Oberfläche des Lampenrohrs mit einem Stoff namens Phosphor (oder fluoreszierendem Material) beschichtet, der das ultraviolette Licht absorbiert und es als sichtbares Licht erneut abgibt.

Leuchtdioden (LEDs), die weißes Licht emittieren können, funktionieren ebenfalls nach einem ähnlichen Prinzip. Das von Halbleitern emittierte Licht ist blau, und dieses blaue Licht kann Leuchtstoffe – etwa Phosphor – anregen, die an der reflektierenden Elektrode angebracht sind, wodurch diese eine orangefarbene Fluoreszenz abgeben. Wenn diese beiden Lichtfarben miteinander gemischt werden, ergeben sie annähernd weißes Licht.

Textmarker

Textmarker enthalten fluoreszierende Farbstoffe, die bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht – etwa Sonnenlicht, Tageslichtlampen oder Quecksilberlampen – einen fluoreszierenden Effekt hervorrufen. Unter UV-Beleuchtung strahlen diese Textmarker weißes Licht aus und verleihen den Farben ein auffälliges, fluoreszierendes Erscheinungsbild. Die Fluoreszenz von Textmarkern unterscheidet sich von der von Uhren oder Leuchtstäben: Leuchtstäbe beruhen auf einer inneren radioaktiven Reaktion, die Strahlung erzeugt, welche wiederum das umgebende fluoreszierende Pulver anregt, Licht zu emittieren. Dadurch können Leuchtstäbe auch in Abwesenheit von UV-Licht nachts weiter leuchten. Im Gegensatz dazu zeigen Textmarker nur dann Fluoreszenz, wenn sie UV-Licht ausgesetzt werden. Sie können dies leicht überprüfen, indem Sie die Markierung des Textmarkers nahe an eine Mückenfalle oder einen Banknotendetektor halten – beide Geräte senden UV-Licht aus.

Biochemisch und medizinisch

Die Fluoreszenz findet breite Anwendungen in den Bereichen Biochemie und Medizin. Mithilfe chemischer Reaktionen können fluoreszierende chemische Gruppen an Biomoleküle angehängt werden; anschließend lassen sich diese Biomoleküle empfindlich nachweisen, indem man die von den markierten Gruppen emittierte Fluoreszenz beobachtet.

DNA-Sequenzierungsprofil, das unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmittels erzeugt wurde.

Die Kettenabbruchmethode zur automatisierten DNA-Sequenzierung: Bei der ursprünglichen Methode mussten die Primerenden der DNA mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden, um eine präzise Identifizierung der DNA-Banden auf dem Sequenziergel zu ermöglichen. In der verbesserten Methode werden die vier Typen von Didesoxynukleotiden (ddNTPs) – die als Kettenabbrüche dienen – jeweils einzeln mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Nach der Elektrophorese trennen sich DNA-Moleküle unterschiedlicher Länge entsprechend ihrer Größe. Bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht emitieren die vier unterschiedlich markierten Didesoxynukleotide Fluoreszenz bei charakteristischen Wellenlängen. Durch Analyse des Fluoreszenzspektrums lässt sich die DNA-Sequenz präzise bestimmen. DNA-Nachweis: Ethidiumbromid ist ein fluoreszierender Farbstoff, der nur sehr schwache Fluoreszenz abgibt, wenn er seine Konformation in Lösung frei ändert. Sobald er jedoch zwischen Basenpaaren in der Doppelhelix von Nukleinsäuren interkalieret und an DNA-Moleküle bindet, erzeugt er intensive Fluoreszenz. Daher wird Ethidiumbromid üblicherweise während der Gelelektrophorese hinzugefügt, um die DNA zu färben. DNA-Mikroarrays (Biochips): Genomische Sonden müssen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden; die Zielsequenzen werden schließlich durch Analyse der resultierenden Fluoreszenzsignale identifiziert. Immunfluoreszenz-Assay in der Immunologie: Antikörper werden mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert, sodass Forscher anhand der Verteilung und Morphologie der Fluoreszenz den Ort und die Beschaffenheit von Antigenen bestimmen können. Durchflusszytometrie (auch bekannt als fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren, FACS): Probenzellen werden mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert und anschließend durch Laserstrahlen angeregt, um spezifische Fluoreszenz zu erzeugen. Die emittierte Fluoreszenz wird von einem optischen System detektiert und an einen Computer übermittelt, wo sie analysiert wird; dadurch lassen sich verschiedene Eigenschaften der Zellen aufdecken. Die Fluoreszenztechnologie wird außerdem eingesetzt, um molekulare Strukturen von DNA und Proteinen zu erkennen und zu analysieren, insbesondere solche komplexer biologischer Makromoleküle. Das Leuchtprotein der Qualle wurde erstmals aus dem marinen Organismus Aequorea victoria isoliert. In Gegenwart von Calciumionen emittiert es grüne Fluoreszenz. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um in Echtzeit die Bewegung von Calciumionen innerhalb von Zellen zu beobachten. Die Entdeckung des Leuchtproteins der Qualle regte weitere Forschungen zu marinen Quallen an und führte zur Identifizierung des Grünfluoreszierenden Proteins (GFP). Die Polypeptidkette des GFP enthält eine einzigartige Chromophor-Struktur, die es ihm ermöglicht, stabile grüne Fluoreszenz unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht zu emittieren, ohne dass zusätzliche Cofaktoren oder spezielle Behandlungen erforderlich wären. Infolgedessen sind GFP und verwandte Proteine zu unverzichtbaren Werkzeugen in der biochemischen und zellbiologischen Forschung geworden. Fluoreszenzmikroskopie: Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie – viele Biomoleküle besitzen eine intrinsische Fluoreszenz und können Fluoreszenz emittieren, ohne dass zusätzliche chemische Gruppen erforderlich wären. Manchmal kann diese intrinsische Fluoreszenz als Reaktion auf Umweltbedingungen variieren, sodass sich diese Umweltsensitivität nutzen lässt, um die Verteilung und Eigenschaften von Molekülen zu erkennen. Zum Beispiel emittiert Bilirubin, wenn es an eine bestimmte Stelle im Serumalbumin gebunden ist, starke Fluoreszenz. Ähnlich produzieren rote Blutkörperchen, denen Eisen fehlt oder die Blei enthalten, statt normalem Häm (Hämoglobin) Zink-Protoporphyrin; dieses Zink-Protoporphyrin zeigt intensive Fluoreszenz und kann daher dazu verwendet werden, die zugrundeliegende Ursache bestimmter Krankheiten zu identifizieren.

Edelsteine, Mineralien

Edelsteine, Mineralien, Fasern und andere Materialien, die als forensische Beweise dienen können, können bei Bestrahlung mit ultravioletter oder Röntgenstrahlung Fluoreszenz von unterschiedlichen Eigenschaften emitieren.

Rubine, Smaragde und Diamanten können unter kurzwelligem ultraviolettem Licht rote Fluoreszenz ausstrahlen. Auch Smaragde, Topas (gelber Jade) und Perlen können unter ultraviolettem Licht fluoreszieren. Darüber hinaus können Diamanten unter Röntgenstrahlung Phosphoreszenz zeigen.

Konzeptionelle Unterscheidung

Die Lumineszenz, die durch Anregung mit Licht (typischerweise Ultraviolett oder Röntgenstrahlen) hervorgerufen wird, nennt man Photolumineszenz; dazu gehören Phänomene wie Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Die Lumineszenz, die durch chemische Reaktionen verursacht wird, wird als Chemilumineszenz bezeichnet; die bei Konzerten verwendeten fluoreszierenden Stäbchen geben Licht durch eine chemische Reaktion ab, die durch das Mischen zweier flüssiger Chemikalien ausgelöst wird. Die Lumineszenz, die durch Kathodenstrahlen (ein Strahl hochenergetischer Elektronen) induziert wird, heißt Kathodolumineszenz – genau so emittiert der fluoreszierende Bildschirm in der Kathodenstrahlröhre eines Fernsehers Licht. Das Phänomen der kalten Lumineszenz in lebenden Organismen wird Biolumineszenz genannt; zum Beispiel wird das von Glühwürmchen abgegebene Licht als «Yingguang» bezeichnet. Im alten Chinesischen wurde das Zeichen «Ying» synonym mit «Ying» verwendet, und in einigen chinesischsprachigen Regionen wird das Zeichen «Ying» spezifisch mit Insekten in Verbindung gebracht. In Taiwan wird Fluoreszenz häufig als «Yingguang» bezeichnet; auf dem chinesischen Festland wird sie eher als «Yingguang» bezeichnet, während «Yingguang» typischerweise spezifisch auf das von Glühwürmchen abgegebene Licht bezogen wird.

Instrument

Die Fluoreszenzmessung erfordert unbedingt ein Instrument. Das häufig verwendete Instrument zur Erfassung der in einer Substanz enthaltenen Fluoreszenzmenge wird als Fluoreszenzspektrophotometer bezeichnet.

Die grundlegende Struktur eines Fluoreszenzanalysators umfasst: eine Anregungslichtquelle, einen Anregungsmonochromator, eine Probenkammer, einen Emissionsmonochromator und ein Detektionssystem.