Ein Fluoreszenzmikroskop ist eine Art optisches Mikroskop. Wenn das zu beobachtende Präparat transparent ist oder seine inneren Strukturen farblich nicht deutlich voneinander unterschieden werden können, ist ein Fluoreszenzmikroskop eine ausgezeichnete Wahl, da es die Beschränkungen gewöhnlicher Mikroskope bei der Beobachtung transparenter Materialien überwinden kann. Das Prinzip eines Fluoreszenzmikroskops beruht darauf, ein mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbtes Präparat mit Licht kurzer Wellenlängen zu beleuchten. Dieses Licht regt die Farbstoffmoleküle an und bewirkt, dass sie Fluoreszenz mit längerer Wellenlänge emittieren. Dadurch können Beobachter die innere Struktur des Präparats genau untersuchen. Bei einem Fluoreszenzmikroskop ist es entscheidend, spezifische Wellenlängen des Anregungslichts aus der Beleuchtungsquelle auszuwählen, um Fluoreszenz zu erzeugen. Anschließend muss die Fluoreszenz vom gemischten Licht, das sowohl aus dem Anregungslicht als auch aus der emittierten Fluoreszenz besteht, getrennt werden, damit sie klar beobachtet werden kann. Daher spielen Filtersysteme, die gezielt bestimmte Wellenlängen durchlassen, in diesem Prozess eine äußerst wichtige Rolle. Fluoreszenzmikroskope werden in vielen Bereichen wie Biologie und Medizin breit eingesetzt.
Ein Fluoreszenzmikroskop besteht aus den folgenden grundlegenden Komponenten:
a. Lichtquelle: Typischerweise eine Xenon-Bogenlampe oder eine Quecksilberlampe; in den letzten Jahren werden jedoch auch Hochleistungs-LEDs eingesetzt.
b. Filter (Einfallslicht): Dieser Filter reduziert die Wellenlänge des einfallenden Lichts, sodass nur die Wellenlänge übrig bleibt, die zur Anregung der Probe benötigt wird; interessanterweise wird er als Anregungsfilter bezeichnet.
c. Zweiwege-dichroitischer Spiegel oder Reflektor: Reflektiert das Anregungslicht auf die Probe und überträgt gleichzeitig nur das von der Probe stammende Emissionslicht zum Detektor (wie in der nachfolgenden Abbildung dargestellt).
d. Emissionsfilter: Er lässt nur die von der Probe stammenden Emissionswellenlängen durch, während er jegliches Licht blockiert, das durch den Anregungsfilter gegangen ist. Wie Sie vielleicht erwarten würden, wird er als Emissionsfilter bezeichnet.
e. CCD-Kamera: Wenn das emittierte Licht nicht erfasst werden kann, ist die Kamera völlig nutzlos. Für die Fluoreszenzbildgebung ist der Detektor in der Regel eine CCD-Kamera, die normalerweise mit einem Computerbildschirm verbunden ist und das Bild für Sie anzeigen kann.
Ein dichroitischer Strahlenteiler lässt Licht mit längeren Wellenlängen durch das Filter passieren und reflektiert gleichzeitig Licht mit kürzeren Wellenlängen.
Klassifizierung des Fluoreszenzmikroskops:
Fluoreszenzmikroskope werden allgemein in zwei Typen unterteilt: Durchlicht- und Auflichtmikroskope.
a. Transmissionsart: Das Anregungslicht stammt von unterhalb des Präparats, und der Kondensor ist ein Dunkelfeldkondensor, der verhindert, dass das Anregungslicht in die Objektivlinse eindringt, gleichzeitig jedoch die Fluoreszenz hindurchgelassen wird. Bei geringer Vergrößerung erscheint das Bild hell; bei hoher Vergrößerung wird es dunkel. Diese Beleuchtungsart ist relativ schwierig einzustellen, wenn man Öl-Immersionsobjektive verwendet oder das Mikroskop zentriert – insbesondere bei der Bestimmung des geeigneten Beleuchtungsbereichs bei niedriger Vergrößerung. Allerdings kann sie einen sehr dunklen Hintergrund für das Präparat erzeugen. Die Transmissionsbeleuchtungsmethode eignet sich nicht für Präparate, die nicht transparent sind.
b. Epi-Beleuchtung: Während die Durchlichtmikroskopie weitgehend ausgedient hat, verwenden die meisten modernen Fluoreszenzmikroskope heute die Epi-Beleuchtung. Bei dieser Konfiguration befindet sich die Lichtquelle oberhalb des Präparats, und ein Strahlteiler ist in den optischen Weg integriert, wodurch das Mikroskop sowohl für durchsichtige als auch für opake Präparate geeignet ist. Da das Objektiv zugleich als Kondensor fungiert, vereinfacht diese Anordnung nicht nur die Bedienung, sondern gewährleistet auch eine gleichmäßige Beleuchtung über das gesamte Gesichtsfeld – von niedriger bis hoher Vergrößerung.
